3/1/:20256

2.2.56. АМИНОКИСЛОТНЫЙ АНАЛИЗ

Аминокислотный анализ относится к методологии, используемой для определения

аминокислотного состава или количественного содержания аминокислот в белках,

пептидах и лекарственных препаратах. Белки и пептиды представляют собой

макромолекулы, состоящие из ковалентно связанных остатков аминокислот, которые

образуют линейные полимеры. Последовательность аминокислот в белках или пептидах

определяет свойства молекулы. Белки представляют собой крупные молекулы, которые

обычно существуют в виде сложных структур со специфической конформацией, в то

время как пептиды имеют меньший размер и могут состоять только из нескольких

аминокислот. Аминокислотный анализ может быть использован для количественного

определения белков и пептидов, идентификации белков или пептидов на основе их

аминокислотного состава, структурного анализа белков и пептидов, оценки стратегий

фрагментации для картирования пептидных остатков и для обнаружения атипичных

аминокислот, которые могут присутствовать в белках или пептидах. Перед

аминокислотным анализом необходимо гидролизовать белки / пептиды до получения

отдельных аминокислотных составляющих. После гидролиза белков/пептидов процесс

аминокислотного анализа может быть таким же, как и для свободных аминокислот в

других лекарственных средствах. Аминокислотные составляющие испытуемого образца

перед анализом обычно подвергаются химической модификации (или дериватизации).

ОБОРУДОВАНИЕ

Методы, используемые для аминокислотного анализа, обычно основаны на

хроматографическом разделении аминокислот, присутствующих в испытуемом образце.

Современные методики анализа основаны на использовании автоматизированных

хроматографических приборов для решения аналитических задач. В качестве прибора для

аминокислотного анализа обычно используют жидкостный хроматограф низкого или

высокого давления, способный создавать градиентное элюирование подвижной фазой, что

обеспечивает разделение анализируемых аминокислот на хроматографической колонке.

Если анализ образца не осуществляется с использованием предколоночной

дериватизации, прибор должен иметь устройство для постколоночной дериватизации. В

качестве детектора обычно используется спектрофотометрический детектор в

ультрафиолетовой/видимой области или флуоресцентный детектор в зависимости от

используемого метода дериватизации. Регистрирующее устройство (например,

интегратор) используется для преобразования аналогового сигнала из детектора и для

проведения количественных расчетов. Предпочтительно, чтобы прибор использовался

исключительно для аминокислотного анализа.

ОБЩИЕ МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

При выполнении аминокислотного анализа аналитик всегда должен учитывать

возможность фонового загрязнения. Необходима высокая степень чистоты реактивов

(например, низкая чистота хлороводородной кислоты может способствовать загрязнению

глицина). Аналитические реактивы должны меняться регулярно каждые несколько

недель, при этом должны использоваться только растворители класса «для

высокоэффективной жидкостной хроматографии». Вероятность загрязнения

микроорганизмами и посторонними частицами, которые могут присутствовать в

растворителях, устраняют путем фильтрования растворителей перед применением,

хранением растворителей в закрытых емкостях и размещением прибора для

аминокислотного анализа в защищенном от прямого солнечного света месте.

Качество аминокислотного анализа определяется лабораторной практикой. Приборы

размещают в местах наименьшего передвижения персонала. Лабораторию содержат в

чистоте. Очищают и калибруют пипетки согласно графику. Наконечники пипеток хранят

в закрытой коробке; аналитикам не позволяется трогать их незащищенными руками.

Аналитик должен использовать неопудренные латексные или аналогичные перчатки.

Ограничивают число открываний и закрываний флакона с испытуемым образцом, так как

пыль может приводить к завышению результатов по содержанию глицина, серина и

аланина.

Для получения удовлетворительных результатов аминокислотного анализа прибор

необходимо обслуживать надлежащим образом. Если прибор используются по

стандартной программе, он должен ежедневно проверяться на отсутствие протечки,

стабильную работу детектора и ламп и способность колонки поддерживать необходимую

степень разделения индивидуальных аминокислот. Согласно графику проводят очистку

или замену всех фильтров прибора и другое техническое обслуживание.

СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ

Необходимые стандартные образцы аминокислот для проведения аминокислотного

анализа коммерчески доступны и обычно представляют собой водный раствор смеси

аминокислот. При определении аминокислотного состава наряду с испытуемым образцом

анализируют стандартные образцы белков или пептидов, которые используют в качестве

контроля для подтверждения полноты всего процесса. Для этой цели в качестве

стандартного образца белка используют высокоочищенный бычий сывороточный

альбумин.

КАЛИБРОВКА ПРИБОРА

Калибровка прибора для аминокислотного анализа обычно включает анализ стандартного

образца аминокислот, состоящего из смеси аминокислот, при разных концентрациях для

определения величины сигнала и рабочего диапазона концентраций для каждой

аминокислоты. Концентрация каждой аминокислоты в стандартном образце известна. В

процессе калибровки при выполнении аминокислотного анализа стандартный образец

разводят до различных концентраций анализируемого вещества в пределах

предполагаемой области линейности согласно используемой аналитической методике.

Затем анализируют растворы с различными концентрациями испытуемого образца. По оси

ординат наносят площади пиков каждой аминокислоты, а по оси абсцисс −

соответствующие известные концентрации каждой аминокислоты с учетом разведений.

Эти результаты позволяют определить область концентраций аминокислот, в которой

зависимость площади пика данной аминокислоты от ее концентрации является линейной

функцией. Важно, чтобы образцы для аминокислотного анализа были приготовлены

таким образом, чтобы концентрации аминокислот в этих образцах находились в пределах

аналитических границ (т.е. в рабочей линейной области) используемой методики с целью

получения точных и воспроизводимых результатов.

Для определения коэффициента сигнала каждой аминокислоты анализируют от четырех

до шести концентраций стандартного образца. Коэффициент сигнала рассчитывается как

среднее значение площади или высоты пика на 1 нмоль (10

-9

моль) аминокислоты,

присутствующей в стандартном образце. Коэффициенты сигнала каждой аминокислоты

используют для расчета концентрации каждой аминокислоты, представленной в

испытуемом образце. Количество вещества (нмоль) анализируемой аминокислоты

рассчитывают путем деления площади пика, соответствующего данной аминокислоте, на

коэффициент сигнала этой аминокислоты. Для рутинного анализа может быть достаточно

калибровки по одной точке; при этом калибровку по коэффициентам сигнала каждой

аминокислоты должна часто обновляться и проверяться для контроля достоверности.

ПОВТОРЯЕМОСТЬ

Полный аминокислотный анализ требует от аналитической лаборатории контроля

повторяемости результатов количественного определения. Во время хроматографического

разделения аминокислот или их производных на хроматограмме наблюдается множество

пиков, относящихся к аминокислотам. Большое количество пиков делает необходимым

наличие программного обеспечения, способного неоднократно идентифицировать пики,

основываясь на времени удерживания, и интегрировать площади пиков для

количественных расчетов. Типичная оценка повторяемости включает приготовление

стандартного раствора аминокислот и анализ многократных повторных вводов пробы

(например, шесть или более повторных вводов) одного и того же стандартного раствора.

Определяют относительное стандартное отклонение значений времени удерживания и

интегрированной площади пика каждой аминокислоты. Оценку повторяемости дополняют

включением многократных количественных определений, проводимых в течение

нескольких дней разными аналитиками. Многократные количественные определения

включают приготовление стандартных разведений из исходных материалов для

определения различий результатов, возникающих из-за манипуляций с образцом. При

оценке повторяемости часто проводят аминокислотный анализ состава стандартного

образца белка (например, бычий сывороточный альбумин). На основе оценки

относительных стандартных отклонений лаборатория рассчитывает аналитические

пределы для подтверждения того, что анализы в данной лаборатории проведены

надлежащим образом. Для гарантии наилучших результатов желательно установить

наименьшие практические пределы отклонений. Факторы, на которые следует обратить

внимание для уменьшения отклонений в результатах аминокислотного анализа, включают

приготовление образца, высокие фоновые спектральные помехи из-за качества реактивов

и/или лабораторных манипуляций, работу и обслуживание приборов, анализ и

интерпретацию данных, профессиональные качества аналитика и его состояние. Все

параметры, о которых идет речь, должны всесторонне исследоваться в рамках проведения

валидации.

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ

Точные результаты аминокислотного анализа требуют использования очищенных

образцов белков и пептидов. Компоненты буфера (например, соли, мочевина, детергенты)

могут повлиять на аминокислотный анализ и должны быть удалены из образца перед

анализом. В методиках с использованием постколоночной дериватизации аминокислот,

компоненты буфера обычно не оказывают значимого влияния по сравнению с методиками

с предколоночной дериватизацией. Желательно ограничить число операций с образцом

для уменьшения потенциально возможного фонового загрязнения, улучшения

открываемости анализируемого вещества и уменьшения трудозатрат. Общие технические

приемы, которые используются для удаления компонентов буфера из образцов белка,

включают следующие методы: (1) введение образца белка в обращенно-фазовую систему

высокоэффективной жидкостной хроматографии, удаление белка с помощью летучего

растворителя, содержащего достаточное количество органического компонента, и

высушивание образца в вакуумной центрифуге; (2) диализ с летучим буферным раствором

или водой; (3) ультрафильтрационное центрифугирование для замены буфера летучим

буферным раствором или водой; (4) осаждение белка из буферного раствора с

использованием органического растворителя (например, ацетона); (5) гель-фильтрацию.

ВНУТРЕННИЕ СТАНДАРТЫ

Внутренний стандарт рекомендуется использовать для контроля физических и

химических потерь и изменений в ходе аминокислотного анализа. Перед гидролизом к

раствору белка может быть прибавлено точно известное количество внутреннего

стандарта. Открываемость внутреннего стандарта указывает на общую открываемость

аминокислот белкового раствора. Однако свободные аминокислоты ведут себя иначе, чем

аминокислоты белка во время гидролиза, скорость высвобождения которых всегда разная.

Поэтому использование внутреннего стандарта для введения поправки на потери в ходе

гидролиза может давать недостоверные результаты, что необходимо учитывать при их

интерпретации. Внутренние стандарты также могут быть добавлены к смеси аминокислот

после гидролиза для введения поправки на различия во введениях пробы образца, на

изменяющуюся стабильность реактивов и на отклонения скорости подвижной фазы. В

идеальном случае в качестве внутреннего стандарта используют коммерчески доступную

аминокислоту, которая отличается от природных аминокислот. Кроме того, внутренний

стандарт должен быть стабильным в ходе гидролиза, его коэффициент сигнала должен

иметь линейную зависимость от концентрации и выходить из хроматографической

колонки со свойственным только этому стандарту временем удерживания без

перекрывания пиков других аминокислот. Наиболее часто используемые стандартные

образцы аминокислот включают норлейцин, нитротирозин и α-аминомасляную кислоту.

ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ

Для аминокислотного анализа белков и пептидов необходимо проводить гидролиз.

Лабораторная посуда, используемая для проведения гидролиза, должна быть очень

чистой. Опудривающий порошок для перчаток, а также отпечатки пальцев на посуде, в

которой проводится гидролиз, могут привести к загрязнению. Для очистки стеклянных

пробирок для проведения гидролиза используют кипячение в течение 1 ч в 1 М

хлороводородной кислоте или замачивание в концентрированной азотной кислоте или

смеси равных объемов концентрированных хлороводородной и азотной кислот. Чистые

пробирки, используемые для гидролиза, промывают водой высокоочищенной, затем

ополаскивают метанолом для хроматографии, сушат в сушильном шкафу в течение ночи и

хранят закрытыми вплоть до использования. Для удаления загрязнения из пробирок,

используемых для гидролиза, также можно использовать прокаливание чистой стеклянной

посуды при температуре 500 °С в течение 4 ч. Допускается использование

соответствующих одноразовых лабораторных принадлежностей.

Кислотный гидролиз является наиболее часто используемым методом для расщепления

белка перед проведением аминокислотного анализа. Метод кислотного гидролиза может

повлиять на отклонение результатов анализа из-за полного или частичного разрушения

некоторых аминокислот: триптофан разрушается, серин и треонин частично разрушаются,

метионин может подвергаться окислению, а цистеин обычно определяется как цистин (но

открываемость цистина обычно низкая вследствие частичного разрушения или

восстановления до цистеина). Применение соответствующего вакуума (менее 200 мкм

ртутного столба, или 26.7 Па) или введение инертного газа (аргона) в пространство

реакционного сосуда может уменьшить степень окислительной деструкции. В пептидных

связях, образованных изолейцином и валином, амидные группы Иле-Иле, Вал-Вал, Иле-

Вал и Вал-Иле гидролизуются частично; аспарагин и глутамин дезамидируются с

образованием соответственно аспарагиновой и глутаминовой кислот. Потеря триптофана,

аспарагина и глутамина в ходе кислотного гидролиза ограничивает количественное

определение до 17 аминокислот. Некоторые из описанных ниже методов кислотного

гидролиза используются для решения этих задач. Некоторые методы гидролиза

(например, методы 4-11) могут приводить к превращениям в другие аминокислоты.

Поэтому преимущества использования конкретной методики оцениваются относительно

задач, решаемых с ее помощью, и всесторонне изучаются перед выбором методики,

отличающейся от обычного кислотного гидролиза.

Для определения исходной концентрации аминокислот, которые частично разрушаются

или медленно отщепляются, часто используют исследование гидролиза во времени

(аминокислотный анализ при кислотном гидролизе в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч). Путем

построения графика зависимости найденной концентрации лабильных аминокислот

(например, серина и треонина) от времени гидролиза и экстраполяции полученной кривой

к началу координат определяют исходную концентрацию этих аминокислот.

Концентрацию остатков аминокислот, которые медленно отщепляются (например,

изолейцин и валин), принимают равной высоте плато на полученном графике зависимости

концентрации остатков от времени гидролиза. Если гидролиз будет протекать слишком

долго, концентрация остатков аминокислот в образце начнет уменьшаться, что указывает

на их разрушение при данных условиях гидролиза.

Приемлемой альтернативой исследованию гидролиза во времени является проведение

гидролиза стандарта аминокислот с известными концентрациями в таких же условиях, что

и испытуемого образца. Аминокислоты в свободном состоянии не могут в полной мере

отражать скорость деструкции при гидролизе лабильных аминокислот, входящих в состав

пептидов или белков. Это особенно справедливо для медленно расщепляющихся

пептидных связей (например, связи Иле-Вал). Однако данная методика позволяет

аналитику учесть лишь некоторую часть разрушающихся аминокислот. Возможно

применение кислотного гидролиза с использованием микроволнового излучения,

который отличается быстротой, но требует специального оборудования, а также

специальных мер предосторожности. Оптимальные условия гидролиза с использованием

микроволнового излучения должны быть установлены для каждого отдельного белкового

/ протеинового образца. Микроволновый гидролиз обычно протекает в течение

нескольких минут, но отклонение даже в одну минуту может привести к

неудовлетворительным результатам (например, неполный гидролиз или разрушение

лабильных аминокислот). Полный протеолиз с применением смеси протеаз может быть

слишком сложным, он требует надлежащего контроля и обычно более подходит для

пептидов, чем для белков.

Для определения оптимальных условий в ходе первоначального анализа белка

неизвестного состава проводят эксперименты с различными временами гидролиза и при

разных температурных режимах.

МЕТОД 1

Кислотный гидролиз с использованием хлороводородной кислоты, содержащей фенол,

является наиболее общей процедурой, используемой для гидролиза белка / пептида при

аминокислотном анализе. Добавление фенола предупреждает реакцию галогенирования

тирозина.

Гидролизующий раствор. 6 М хлороводородная кислота, содержащая от 0.1 % до 1.0 %

фенола.

Методика

Жидкофазный гидролиз. Образец белка / пептида помещают в пробирку для гидролиза и

высушивают (образец сушат для того, чтобы вода в образце не разбавляла кислоту,

используемую для гидролиза). Прибавляют гидролизующий раствор из расчета 200 мкл на

500 мкг лиофилизированного белка. Образец в пробирке замораживают в бане с сухим

льдом и ацетоном и и герметизируют в вакууме. Образцы обычно гидролизуют при

температуре 110 °С в течение 24 ч в вакууме или в атмосфере инертного газа для

предотвращения окисления. Если есть подозрение, что испытуемый белок полностью не

гидролизуется, рассматривают возможность проведения гидролиза в течение более

продолжительного времени (например, 48 ч и 72 ч).

Парофазный гидролиз. Это один из наиболее общих методов кислотного гидролиза. Он

предпочтителен для микроанализа, когда доступны лишь небольшие количества образца.

При использовании парофазного гидролиза контаминация образца кислотными

реактивами минимизирована. Флаконы с высушенными образцами помещают в сосуд,

содержащий подходящее количество гидролизующего раствора. Гидролизующий раствор

не должен контактировать с испытуемым образцом. В свободном пространстве сосуда

создают инертную атмосферу или вакуум (менее 200 мкм ртутного столба, или 26.7 Па) и

для проведения гидролиза нагревают при температуре около 110 °С в течение 24 ч. Пары

кислоты гидролизуют сухой образец. Возможность конденсации кислоты в пробирках с

образцом должна быть сведена к минимуму. После гидролиза испытуемый образец сушат

в вакууме до удаления остатков кислоты.

МЕТОД 2

Использование меркаптоэтансульфоновой кислоты в качестве восстанавливающей

кислоты уменьшает окисление триптофана в процессе гидролиза.

Гидролизующий раствор. 2.5 М раствор меркаптоэтансульфоновой кислоты.

Парофазный гидролиз. От 1 мкг до 100 мкг испытуемого белка/пептида сушат в

пробирке для гидролиза. Пробирку помещают в большую пробирку, содержащую около

200 мкл гидролизующего раствора. Герметично запаивают большую пробирку в вакууме

(около 50 мкм ртутного столба, или 6.7 Па). Нагревают пробирку для гидролиза до

температуры от 170 °С до 185 °С в течение 12.5 мин. После гидролиза пробирку с

образцом сушат в вакууме в течение 15 мин до удаления остатков кислоты.

МЕТОД 3

Использование тиогликолевой кислоты в качестве восстанавливающей кислоты

предотвращает окисление триптофана при гидролизе.

Гидролизующий раствор. 7 М хлороводородная кислота, содержащая 1 % фенола, 10 %

трифторуксусной кислоты и 20 % тиогликолевой кислоты.

Парофазный гидролиз. От 10 мкг до 50 мкг испытуемого белка / пептида высушивают в

пробирке для образца. Пробирку для образца помещают в пробирку большего размера,

содержащую около 200 мкл гидролизующего раствора. Большую пробирку герметично

запаивают в вакууме (около 50 мкм ртутного столба, или 6.7 Па). Нагревают пробирку для

гидролиза до температуры 166 °С в течение 15−30 мин. После гидролиза для удаления

остатков кислоты пробирку с образцом сушат в вакууме в течение 5 мин. Открываемость

триптофана в этом методе зависит от количества испытуемого образца.

МЕТОД 4

Перед гидролизом белка проводят окисление цистеина или цистина и метионина

надмуравьиной кислотой.

Окисляющий раствор. Смешивают 1 объем 30 % раствора водорода пероксида и 9

объемов муравьиной кислоты безводной и выдерживают при комнатной температуре в

течение 1 ч. Полученную надмуравьиную кислоту используют свежеприготовленной.

Методика. Образец белка / пептида растворяют в 20 мкл муравьиной кислоты безводной,

нагревают при температуре 50 °С в течение 5 мин и прибавляют 100 мкл окисляющего

раствора. Процесс окисления проводят в течение 10−30 мин. В данной реакции цистеин

превращается в цистеиновую кислоту, а метионин − в метионинсульфон. Избыток

реактива удаляют из образца при помощи вакуумного центрифугирования. Окисленный

белок может быть затем гидролизован по методу 1 или методу 2. При наличии

галогенидов эта методика может приводить к модификации остатков тирозина.

МЕТОД 5

Окисление цистеина или цистина происходит во время жидкофазного гидролиза с натрия

азидом.

Гидролизующий раствор. К 6 М хлороводородное кислоте, содержащей 0.2 % фенола,

прибавляют натрия азид до получения конечной концентрации 2 г/л. Прибавление фенола

предотвращает галогенирование тирозина.

Жидкофазный гидролиз. Гидролиз белка / пептида проводят при температуре около

110 °С в течение 24 ч. Во время гидролиза присутствующий в образце цистеин или цистин

преобразуется в цистеиновую кислоту под воздействием натрия азида, содержащегося в

гидролизном растворе. Данная методика приводит к лучшей открываемости тирозина, чем

метод 4, но она не подходит для количественного определения метионина. Метионин

преобразуется в смесь из метионина и двух продуктов его окисления —

метионинсульфоксида и метионинсульфона.

МЕТОД 6

Окисление цистеина/цистина происходит под воздействием диметилсульфоксида.

Гидролизующий раствор. К 6 М хлороводородной кислоте, содержащей от 0.1 % до

1.0 % фенола, прибавляют диметилсульфоксида до получения раствора с конечной

концентрацией 2 % (об/об).

Парофазный гидролиз. Гидролиз белка/пептида проводят при температуре около 110 °С

в течение 24 ч. Во время гидролиза присутствующий в образце цистеин/цистин

преобразуется в цистеиновую кислоту под воздействием диметилсульфоксида,

содержащегося в гидролизном растворе. С целью ограничения разброса данных и

компенсации частичного разрушения рекомендуется оценивать открываемость

цистеиновой кислоты при окислительном гидролизе стандартного образца белка,

содержащего 1−8 остатков цистеина. Коэффициент сигнала гидролизата белка или

пептида обычно на 30 % ниже, чем для негидролизованного стандартного образца

цистеиновой кислоты. Так как гистидин, метионин, тирозин и триптофан также

модифицируются, полный анализ состава при использовании этой методики невозможен.

МЕТОД 7

Восстановление и алкилирование цистеина или цистина происходит при

пиридилэтилировании в паровой фазе.

Восстанавливающий раствор. 83.3 мкл пиридина, 16.7 мкл 4-винилпиридина, 16.7 мкл

трибутилфосфина и 83.3 мкл воды помещают в подходящий контейнер и перемешивают.

Методика. Пробирку для гидролиза с образцом белка / пептида (от 1 мкг до 100 мкг)

помещают в пробирку большего размера. Переносят восстанавливающий раствор в

большую пробирку, герметично запаивают в вакууме (около 50 мкм ртутного столба, или

6.7 Па) и нагревают при температуре около 100 °С в течение 5 мин. Затем внутреннюю

пробирку для гидролиза помещают в вакуумный эксикатор и сушат в течение 15 мин для

удаления остатков реактивов. Пиридилэтилированный образец затем гидролизуют,

согласно описанной ранее методике. Для оценки открываемости пиридилэтилцистеина

параллельно проводят реакцию пиридилэтилирования стандартного образца белка,

содержащего 1—8 остатков цистеина. Длительное время инкубации при реакции

пиридилэтилирования может быть причиной модификации концевых α-аминогрупп и ε-

аминогрупп лизина в белке.

МЕТОД 8

Восстановление и алкилирование цистеина или цистина происходит при

пиридилэтилировании в жидкой фазе.

Исходные растворы. Готовят и фильтруют три раствора: 1 М раствор трис-гидрохлорида

с рН 8.5, содержащий 0.004 М динатрия эдетата (исходный раствор А); 8 М раствор

гуанидина гидрохлорида (исходный раствор В); и 10 % раствор 2-меркаптоэтанола

(исходный раствор С).

Восстанавливающий раствор. Для получения буферного раствора 6 М раствора

гуанидина гидрохлорида в 0.25 М растворе трис-гидрохлорида смешивают 1 объем

исходного раствора А и 3 объема исходного раствора В.

Методика. Около 10 мкг испытуемого образца растворяют в 50 мкл восстанавливающего

раствора и прибавляют около 2.5 мкл исходного раствора С. Выдерживают при комнатной

температуре в защищенном от света месте в атмосфере азота или аргона в течение 2 ч.

Для проведения реакции пиридинэтилирования к раствору белка прибавляют около 2 мкл

4-винилпиридина и выдерживают дополнительно 2 ч при комнатной температуре в

защищенном от света месте. Обессоливают белок или пептид методом обращенно-

фазовой ВЭЖХ, собирая белковую или пептидную фракцию. Перед кислотным

гидролизом собранный образец может быть высушен при помощи вакуумного

центрифугирования.

МЕТОД 9

Восстановление и алкилирование цистеина/цистина происходит при

карбоксиметилировании в жидкой фазе.

Исходные растворы. Готовят как указано в методе 8.

Раствор для карбоксиметилирования. Готовят раствор 100 г/л йодацетамида в 96 %

этаноле.

Буферный раствор. Используют восстанавливающий раствор, приготовленный как

указано в методе 8.

Методика. Испытуемый образец растворяют в 50 мкл буферного раствора и прибавляют

около 2.5 мкл исходного раствора С. Выдерживают при комнатной температуре в

защищенном от света месте в атмосфере азота или аргона в течение 2 ч. Прибавляют

раствор для карбоксиметилирования в 1.5-кратном количестве от общего теоретического

содержания тиолов, и выдерживают дополнительно в течение 30 мин при комнатной

температуре в защищенном от света месте. Если содержание тиолов в белке неизвестно,

прибавляют 5 мкл 0.1 М раствора йодацетамида на каждые 20 нмоль испыту-емого образца

белка. Для прекращения реакции прибавляют избыток 2-мер-каптоэтанола. Обессоливают

белок или пептид методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной

хроматографии, собирая белковую или пептидную фракцию. Перед кислотным гидролизом

собранный образец может быть высушен при помощи вакуумного центрифугирования. В

процессе кислотного гидролиза полученный S-карбо-ксиамидометилцистеин будет

превращаться в S-карбоксиметил-цистеин.

МЕТОД 10

Цистеин или цистин, прореагировавший с дитиогликолевой кислотой или

дитиодипропионовой кислотой, образует смешанный дисульфид. Выбор дитиогликолевой

кислоты или дитиодипропионовой кислоты зависит от требуемого разрешения методики

аминокислотного анализа.

Восстанавливающий раствор. Раствор 10 г/л дитиогликолевой кислоты (или

дитиодипропионовой кислоты) в 0.2 М растворе натрия гидроксида.

Методика. Около 20 мкг испытуемого образца помещают в пробирку для гидролиза и

прибавляют 5 мкл восстанавливающего раствора. Прибавляют 10 мкл изопропилового

спирта и удаляют всю жидкость из образца при помощи вакуумного центрифугирования.

Образец гидролизуют, используя Метод 1. Преимущество данного метода заключается в

том, что остатки других аминокислот не участвуют в побочных реакциях, а образец не

нуждается в обессоливании перед гидролизом.

МЕТОД 11

Аспарагин и глутамин в процессе кислотного гидролиза преобразуются в аспарагиновую

кислоту и глутаминовую кислоту, соответственно. Остатки аспарагина и аспарагиновой

кислоты обозначают как Asx, а остатки глутамина и глутаминовой кислоты обозначают

как Glx. Белки / пептиды могут взаимодействовать с бис(1,1-трифтораце-

токси)йодбензолом, превращая при гидролизе остатки аспарагина и глутамина в остатки

диаминопропионовой кислоты и диаминомасляной кислоты, соответственно. Эти

превращения позволяют определять в белке / пептиде содержание аспарагина и глутамина

в присутствии остатков аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

Восстанавливающие растворы. Готовят и фильтруют 3 раствора: 0.01 М раствор

трифторуксусной кислоты (раствор А); 5 М раствор гуанидина гидрохлорида,

содержащий 0.01 М трифторуксусной кислоты (раствор В); свежеприготовленный раствор

диметилформамида, содержащий 36 мг/мл бис(1,1-трифтораце-токси)йодбензолом

(раствор С).

Методика. Около 200 мкг испытуемого образца помещают в чистую пробирку для

гидролиза и прибавляют 2 мл раствора А или раствора В и 2 мл раствора С. Пробирку для

гидролиза герметично запаивают в вакууме. Испытуемый образец нагревают при

температуре 60 °С в течение 4 ч в защищенном от света месте. Затем образец подвергают

диализу водой для удаления избытка реактивов. Диализированный образец трижды

экстрагируют равными объемами бутилацетата и лиофилизируют. Белок может быть

затем гидролизован согласно описанной ранее методике. Остатки α,β-

диаминопропионовой кислоты и α,γ-диаминомасляной кислоты обычно не отделяются от

остатков лизина ионообменной хроматографией, используемой при аминокислотном

анализе. Таким образом, при использовании ионного обмена для разделения при

аминокислотном анализе содержание аспарагина и глутамина представляет собой разницу

между количественным содержанием аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты,

полученным при кислотном гидролизе без дериватизации и с бис(1,1-трифтораце-

токси)йодбензолом дериватизацией. Количественное содержание треонина, метионина,

цистеина, тирозина и гистидина может изменяться при бис(1,1-трифтораце-

токси)йодбензолом дериватизации; при необходимости определения этих

аминокислотных остатков белка / пептида следует проводить гидролиз без бис(1,1-

трифтораце-токси)йодбензолом дериватизации.

МЕТОДОЛОГИЯ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА: ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

Существует множество способов аминокислотного анализа. Выбор конкретного способа

зачастую определяется требуемой чувствительностью количественного определения. В

целом, около половины применяемых способов аминокислотного анализа основаны на

разделении свободных аминокислот посредством ионообменной хроматографии с

последующей постколоночной дериватизацией (например, с нингидрином или о-

фталевым альдегидом). Методы постколоночной дериватизации могут быть использованы

для образцов, содержащих небольшое количество буферных компонентов (таких как соли

и мочевина) и обычно требует от 5 мкг до 10 мкг испытуемого образца белка для

проведения одного анализа. Остальные методы аминокислотного анализа обычно

включают предколоночную дериватизацию свободных аминокислот (например,

фенилизотиоцианатом; 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбаматом или о-

фталевым альдегидом; (диметиламино)азобензолсульфонилхлоридом; 9-фторенилме-

тилхлорформиатом; 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом) с последую-щим

обращенно-фазовым ВЭЖХ анализом. Метод предколоночной дериватизации отличается

высокой чувствительностью (обычно требуется от 0.5 мкг до 1.0 мкг испытуемого образца

белка для проведения одного анализа), однако на него могут оказывать влияние

компоненты солевого буфера, содержащиеся в испытуемом образце. Предколоночная

дериватизация может привести к образованию производных одной аминокислоты, что

приводит к усложнению интерпретации результатов.

Для количественного аминокислотного анализа могут быть использованы приведенные

ниже методы. Приборы и реактивы для проведения этих испытаний коммерчески

доступны. Кроме того, многие из этих методов имеют модификации с различным

приготовлением реактивов, проведением химических реакций, различными

хроматографическими системами и так далее. Специфические параметры могут

отличаться в зависимости от конкретного оборудования и методики выполнения анализа.

Многие лаборатории используют несколько методик аминокислотного анализа, так как

каждая из них имеет свои преимущества. В каждой из этих методик аналоговый сигнал

обнаруживается с помощью системы сбора данных, а площади пиков используются для

количественного определения.

МЕТОД 1. ПОСТКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С НИНГИДРИНОМ

Ионообменная хроматография с постколоночной дериватизацией с нингидрином является

одним из наиболее распространенных методов, предназначенных для количественного

аминокислотного анализа. Как правило, для анализа большинства сложных

физиологических образцов пригодной является катионообменная система на основе ионов

лития, а быстрая катионообменная система на основе ионов натрия используется для

более простых смесей аминокислот, полученных при гидролизе белков (обычно 17

аминокислот). Разделение аминокислот на ионообменной колонке достигается подбором

рН и ионной силы. Для улучшения разделения часто используют температурный

градиент.

При взаимодействии аминокислоты с нингидрином образуется продукт с характерным

фиолетовым или желтым цветом. Аминокислоты, за исключением иминокислот, образуют

продукт фиолетового цвета, имеющий максимум поглощения при 570 нм. Иминокислоты,

такие как пролин, образуют продукт желтого цвета, имеющий максимум поглощения при

440 нм.

Продукты постколоночной реакции между нингидрином и элюируемыми из колонки

аминокислотами детектируются при длинах волн 440 нм и 570 нм, а полученную

хроматограмму используются для определения аминокислотного состава.

Предел обнаружения для большинства производных аминокислот обычно составляет 10

пмоль, а для производных пролина − 50 пмоль. Линейность сигнала наблюдается в

области (20−500) пмоль с коэффициентом корреляции более 0.999. Для получения

удовлетворительных данных рекомендуется перед гидролизом использовать образцы

белка/пептида массой более 1 мкг.

МЕТОД 2. ПОСТКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С О-ФТАЛЕВЫМ АЛЬДЕГИДОМ

о-фталевый альдегид реагирует с первичными аминами в присутствии тиольных

соединений, образуя производные изоиндола с сильной флуоресценцией. Эту реакция

используется для постколоночной дериватизации при аминокислотном анализе методом

ионообменной хроматографии. Условия разделения такие же, как указано в методе 1.

Для образования флуоресцирующих производных с о-Фталевым альдегидом вторичные

амины (иминокислоты, такие как пролин) предварительно окисляют натрия гипохлоритом

или хлорамином Т. В методике используются сильнокислотные катионообменные

колонки для разделения свободных аминокислот с последующим постколоночным

окислением натрия гипохлоритом или хлорамином Т и постколоночной дериватизацией с

использованием о-фталевого альдегида и тиольных соединений, таких как N-ацетил-L-

цистеин или 2-меркаптоэтанол. Длительное воздействие натрия гипохлорита или

хлорамина Т не оказывает заметного влияния на дериватизацию первичных аминокислот.

Разделение аминокислот на ионообменной колонке достигается подбором рН и ионной

силы. После постколоночной дериватизации элюируемых аминокислот с о-фталевый

альдегид продукты реакции проходят через флуориметрический детектор. Интенсивность

флуоресценции о-фталевый альдегид производных аминокислот измеряется при длине

волны возбуждающего света 348 нм и длине волны излучаемого света 450 нм.

Предел обнаружения для большинства о-фталевый альдегид производных аминокислот

обычно составляет несколько десятков пикомоль. Линейность сигнала наблюдается в

области от нескольких пикомоль до нескольких десятков наномоль. Для получения

удовлетворительных данных рекомендуется перед гидролизом использовать образцы

белка/пептида массой более 500 нг.

МЕТОД 3. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С ФЕНИЛИЗОТИОЦИАНАТОМ

Фенилизотиоцианат реагирует с аминокислотами с образованием фенилтиокарбамильных

производных, которые могут быть обнаружены с высокой чувствительностью при длине

волны 254 нм. Предколоночная дериватизация аминокислот с фенилизотиоцианатом

проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой

высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым

спектрофотометрическим детектированием.

После удаления реактива под вакуумом сухие замороженные производные аминокислот

могут храниться без заметной деструкции в течение нескольких недель. Раствор пробы

для введения может храниться в холодном месте в течение трех дней без заметных

изменений хроматографического сигнала.

Разделение фенилтиокарбамильных производных аминокислот методом обращенно-

фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке, заполненной

силикагелем октадецилсилильным достигается путем подбора концентрации

ацетонитрила и ионной силы буферного раствора. Элюируемые из колонки

фенилтиокарбамильные производные аминокислот определяют при длине волны 254 нм.

Предел обнаружения для большинства фенилтиокарбамильных производных аминокислот

обычно составляет 1 пмоль. Линейность сигнала наблюдается в области 20−500 пмоль с

коэффициентом корреляции более 0.999. Для получения удовлетворительных данных

рекомендуется перед гидролизом использовать образцы массой более 500 нг.

МЕТОД 4. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 6-АМИНОХИНО-ЛИЛ-N-

ГИДРОКСИСУКЦИНИ-МИДИЛКАРБАМАТОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с 6-аминохинолил-N-гидрокси-

сукцинимидилкарбаматом проводится перед разделением смеси аминокислот методом

обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Аминокислота с 6-

аминохинолил-N-гидрокси-сукцинимидилкарбаматом реагирует с аминокислотами с

образованием стабильных флуоресцирующих несимметричных производных мочевины

(аминокислота с 6-аминохинолил-N-гидрокси-сукцинимидилкарбаматом-аминокислот),

которые легко поддаются анализу методом обращенно-фазовой высокоэффективной

жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием.

Разделение аминокислоты с 6-аминохинолил-N-гидрокси-сукцинимидилкарбаматом

производных аминокислот методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной

хроматографии на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным, достигается

подбором концентрации ацетонитрила и ионной силы буферного раствора. Селективное

флуоресцентное детектирование производных при длине волны возбуждающего света 250

нм и при длине волны излучаемого света 395 нм допускает прямой ввод реакционной

смеси без каких-либо существенных поправок на основной флуоресцирующий побочный

продукт − 6-аминохинолин. Избыток реактива быстро гидролизуется (t

1/2

< 15 с) с

образованием 6-аминохинолина, N-гидроксисукцинимида и диоксида углерода, а через 1

мин дальнейшее образование производных не происходит.

Площади пиков для аминокислоты с 6-аминохинолил-N-гидрокси-

сукцинимидилкарбаматом-аминокислот, по существу, не изменяются, по меньшей мере, в

течение 1 недели хранения растворов при комнатной температуре. Следовательно,

аминокислота с 6-аминохинолил-N-гидрокси-сукцинимидилкарбаматом-аминокислоты

обладают более чем достаточной стабильностью для проведения круглосуточного

автоматического хроматографического анализа. Предел обнаружения для каждой

аминокислоты, кроме цистеина, находится в области от 40 фмоль до 320 фмоль.

Предел обнаружения для цистеина составляет около 800 фмоль. Линейность сигнала

наблюдается в области 2.5−500 мкмоль с коэффициентом корреляции более 0.999. Для

получения удовлетворительных данных рекомендуется перед гидролизом использовать

образцы белка / пептида массой более 30 нг.

МЕТОД 5. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С О-ФТАЛЕВЫМ АЛЬДЕГИДОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с о-фталевым альдегидом проводится перед

разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой высокоэффективной

жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием. Метод не позволяет

определять аминокислоты, являющиеся вторичными аминами (например, пролин).

о-фталевый альдегид в присутствии тиольных соединений реагирует с первичной

аминогруппой, образуя производные изоиндола с сильной флуоресценцией. В качестве

тиольных соединений могут быть использованы 2-меркап-тоэтанол и 3-

меркаптопропионовая кислота. о-фталевый альдегид не обладает флуоресценцией и,

следовательно, не образует мешающих пиков. Кроме того, его растворимость и

стабильность в водном растворе, наряду с высокой скоростью реакции, позволяет

проводить автоматическую дериватизацию с использованием автодозатора для

смешивания испытуемого образца и реагента. Основным недостатком о-фталевого

альдегида является отсутствие у него способности реагировать со вторичными

аминокислотами (например, пролином). Компенсировать данный недостаток можно

сочетанием с методиками, описанными в методе 7 или методе 8.

Предколоночная дериватизация аминокислот с о-фталевым альдегидом используется для

пробоподготовки перед обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной

хроматографии. Так как о-фталевые альдегидные производные аминокислот неустойчивы,

анализ и разделение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии проводят

немедленно после дериватизации. Хроматограф для жидкостной хроматографии должен

быть оснащен флуометрическим детектором для обнаружения производных аминокислот.

Интенсивность флуоресценции о-фталевых альдегидных производных аминокислот

измеряют при длине волны возбуждающего света 348 нм и длине волны излучаемого

света 450 нм.

Заявленный предел обнаружения при флуориметрическом детектировании не ниже 50

фмоль, однако на практике предел обнаружения составляет 1 пмоль.

МЕТОД 6. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С

(ДИМЕТИЛАМИНО)АЗОБЕНЗОЛСУЛЬФОНИЛХЛОРИДОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с (диметиламино)азобензолсульфонилхло-

ридом проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой

высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим

детектированием в видимой области спектра. (Диметиламино)азобензолсульфонилхлорид

является хромофорным реактивом и используется для маркировки аминокислот.

Аминокислоты, маркированные (диметиламино)азобензолсульфонилхлоридом обладают

высокой стабильностью и проявляют максимум поглощения при 436 нм.

(Диметиламино)азобензолсульфонилхлорид-аминокислоты всех встречающихся в

природе производных аминокислот могут быть разделены на колонке, заполненной

силикагелем октадецилсилильным, методом обращенно-фазовой высокоэффективной

жидкостной хроматографии с использованием градиентного элюирования и подвижной

фазы, состоящей из ацетонитрила и водной буферной смеси. Элюируемые из колонки

(диметиламино)азобензолсульфонилхлорид-аминокислоты определяют при длине волны

436 нм. Метод позволяет проводить с одинаковой чувствительностью анализ как

аминокислот, так и иминокислот (таких как пролин). Метод дериватизации с

(диметиламино)азобензолсульфонилхлорид позволяет количественно определять остатки

триптофана, полученные при гидролизе белка/пептида с сульфоновыми кислотами

(такими как кислота меркаптоэтансульфоновая, кислота п-толуолсульфоновая или кислота

метансульфоновая) как указано в Методе 2, описанном в разделе Гидролиз белков. Другие

лабильные остатки аминокислот, такие как аспарагин и глутамин, можно анализировать

как и предыдущие после преобразования их в кислоту диаминопропионовую и кислоту

диаминомасляную соответственно, как указано в методе 11, описанном в разделе

Гидролиз белков.

В качестве внутреннего стандарта для этого метода не может быть использован

норлейцин, так как он элюируется в области хроматограммы со скоплением пиков

первичных аминокислот. В качестве внутреннего стандарта может быть использован

нитротирозин, который элюируется в свободной от пиков области хроматограммы.

Предел обнаружения (диметиламино)азобензолсульфонилхлорид-аминокислот обычно

составляет 1 пмоль. Предел определения (диметиламино)азобензолсульфонилхлорид-

аминокислот − 2−5 пмоль. Для получения удовлетворительных данных рекомендуется для

одного анализа использовать 10−30 нг (диметиламино)азобензолсульфонилхлорид-

производных белкового гидролизата.

МЕТОД 7. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 9-ФТОРЕНИЛМЕ-

ТИЛХЛОРФОРМИАТОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с 9-фторенилметилхлор-формиатом

проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой

высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием.

9-фторенилметилхлор-формиат взаимодействует с первичными и вторичными

аминокислотами с образованием производных с сильной флуоресценцией. Реакция

протекает в мягких условиях в водном растворе в течение 30 с. Полученные производные

стабильны, за исключением подверженных деструкции производных гистидина. Несмотря

на то, что 9-фторенилметилхлор-формиат сам по себе обладает флуоресценцией, избыток

9-фторенилметилхлор-формиат и флуоресцирующие побочные продукты реакции могут

быть удалены без потерь 9-фторенилметилхлор-формиат-аминокислот.

9-фторенилметилхлор-формиат-аминокислоты могут быть разделены на колонке,

заполненной силикагелем октадецилсилильным, методом обращенно-фазовой

высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разделение проводят по программе

градиентного элюирования с линейным изменением состава подвижной фазы от смеси

ацетонитрил − метанол – ацетатный буферный раствор (10:40:50, об/об/об) до смеси

ацетонитрил − ацетатный буферный раствор (50:50, об/об). В результате такого

элюирования 20 производных аминокислот разделяются в течение 20 мин. Элюируемые

из колонки производные аминокислот определяют при длине волны возбуждающего света

260 нм и длине волны излучаемого света 313 нм.

Предел обнаружения находится в нижнем фемтомолярном диапазоне. Линейность сигнала

для большинства аминокислот наблюдается в области 0.1−50 мкмоль.

МЕТОД 8. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 7-ФТОР-4-НИТРО-БЕНЗО-2-

ОКСА-1,3-ДИАЗОЛОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом

проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с

флуориметрическим детектированием.

7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол взаимодействует с первичными и вторичными

аминокислотами с образованием производных с сильной флуоресценцией. Аминокислоты

дериватизируются с 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол при нагревании до 60 °С в

течение 5 мин.

7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол-производные аминокислот могут быть разделены

на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным, методом обращенно-фазовой

высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием программы

градиентного элюирования и подвижной фазы, состоящей из ацетонитрила и водной

буферной смеси. В результате такого элюирования 17 производных аминокислот

разделяются в течение 35 мин. В качестве внутреннего стандарта может быть

использована ε-аминокапроновая кислота, которая элюируется в свободной от пиков

области хроматограммы. Элюируемые из колонки производные аминокислот определяют

при длине волны возбуждающего света 480 нм и длине волны излучаемого света 530 нм.

Чувствительность данного метода почти такая же, как в предколоночной дериватизации с

о-фталевым альдегидом (метод 5), за исключением пролина, который не реагирует с о-

фталевым альдегидом (преимущественное отличие метода с 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-

1,3-диазолом). Предел обнаружения для каждой аминокислоты составляет около 10

фмоль. Анализ проводят с использованием 1.5 мг белкового гидролизата в

предколоночной реакционной смеси.

РАСЧЕТ И АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ

При определении содержания аминокислот в белковом / пептидном гидролизате следует

учитывать, что при кислотном гидролизе триптофан и цистеин разрушаются, серин и

треонин разрушаются частично, в то время как связи по остаткам изолейцина и валина

расщепляются не полностью. Метионин во время кислотного гидролиза может

подвергаться окислению, в результате чего появляются свободные аминокислоты

(например, глицин и серин), загрязняющие образец. Использование вакуума (менее 200

мкм ртутного столба, или 26.7 Па) или введение инертного газа (аргон) в пространство

реакционного сосуда может уменьшить степень окислительной деструкции. Поэтому

количественные результаты, полученные для цистеина, триптофана, треонина,

изолейцина, валина, метионина, глицина и серина из белкового или пептидного

гидролизата, могут быть непостоянными и служить основанием для дальнейшего

исследования и анализа.

Мольный процент аминокислоты представляет собой количество остатков

определенной аминокислоты на 100 остатков в белке. Эта величина может быть полезной

при оценке данных, полученных при аминокислотном анализе, если молекулярная масса

исследуемого белка неизвестна. Информация также может быть использована для

подтверждения подлинности белка/пептида или для других целей. Мольный процент

каждой аминокислоты в испытуемом образце рассчитывают по формуле:

100

где:

–

сигнал пика аминокислоты в испытуемом образце, проинтегрированный в

наномолях;

–

сумма сигналов пиков всех аминокислот в испытуемом образце,

проинтегрированных в наномолях.

Сравнение полученного в испытании мольного процента аминокислот с данными

известных белков может помочь установить или подтвердить подлинность испытуемого

образца белка.

Образцы неизвестного белка. Этот метод расчета может быть использован для оценки

концентрации белка в образце неизвестного белка с использованием данных, полученных

при аминокислотном анализе. Массу каждой высвобождаемой аминокислоты

рассчитывают в микрограммах по формуле:

1000

Mm

где:

–

количество аминокислоты, определенное в испытании, в наномоль;

–

средняя молекулярная масса данной аминокислоты, скорректированная с

учетом массы молекулы воды, удаленной при образовании пептидной

связи.

Суммируя массы высвобожденных аминокислот, получают общую массу анализируемого

белка после соответствующей коррекции с учетом частично или полностью разрушенных

аминокислот. Если известна молекулярная масса неизвестного белка (например,

определенная методом гель-электрофореза в полиакриламидном геле с натрия

додецилсульфатом или методом масс-спектрометрии), можно установить

аминокислотный состав неизвестного белка. Число остатков каждой аминокислоты

рассчитывают по формуле:















1000

где:

–

количество аминокислоты определенное в испытании, в наномолях;

–

общая масса белка, в микрограммах;

–

молекулярная масса неизвестного белка.

Образцы известного белка. Этот метод расчета может быть использован для

установления аминокислотного состава и концентрации белка в образце белка с известной

молекулярной массой и аминокислотным составом с использованием данных, полученных

при аминокислотном анализе. При анализе состава известного белка учитывают, что

некоторые аминокислоты высвобождаются хорошо, в то время как открываемость других

аминокислот может быть затруднена вследствие полного или частичного разрушения

(например, триптофан, цистеин, треонин, серин, метионин), неполного расщепления

связей (например, изолейцин и валин), контаминации свободными аминокислотами

(например, глицин и серин).

Для определения количественного содержания белка используют аминокислоты,

открываемость которых наилучшая. Хорошо открываемыми аминокислотами обычно

являются: аспартат−аспарагин, глутамат−глутамин, аланин, лейцин, фенилаланин, лизин и

аргинин. Этот перечень может изменяться на основании наработанного опыта по

проведению анализа. Для определения количественного содержания белка по каждой

хорошо открываемой аминокислоте количество каждой хорошо открываемой

аминокислоты, в наномоль, делят на предполагаемое количество остатков этой

аминокислоты в белке. Рассчитывают среднее значение содержания белка. Значения

содержания белка, установленные по количеству каждой хорошо открываемой

аминокислоты, должны быть равномерно распределены относительно среднего значения

величины. В тех случаях, когда значения содержания белка, определенные по этим

аминокислотам, имеют неприемлемые отклонения (обычно более 5 %) от средней

величины, их отбрасывают. С учетом оставшихся значений пересчитывают среднее

содержание белка в испытуемом образце. Для определения аминокислотного состава

испытуемого образца содержание каждой аминокислоты делят на рассчитанное среднее

значение содержания белка. Относительную ошибку определения аминокислотного

состава рассчитывают в процентах по формуле:

m100

где:

–

экспериментально установленное количество аминокислот в наномолях

на аминокислотный остаток;

–

известное значение остатков для данной аминокислоты.

Среднее значение относительной ошибки определения аминокислотного состава является

средним значением абсолютных величин относительных ошибок определения каждой

аминокислоты, обычно кроме расчета данных по триптофану и цистеину. Средняя

величина относительной ошибки определения аминокислотного состава может дать

важную информацию об устойчивости анализа во времени. Соответствие найденного

аминокислотного состава образца белка и известного состава может служить

подтверждением подлинности и чистоты белка в испытуемом образце.